PRAKTIKUM 2 PERHITUNGAN DAN PEMBUATAN STOK NUTRISI PENYUSUN MEDIA

Transcription

1 PRAKTIKUM 2 PERHITUNGAN DAN PEMBUATAN STOK NUTRISI PENYUSUN MEDIA I. PENDAHULUAN Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan, sangat bergantung pada media yang digunakan. Media kultur jaringan tanaman menyediakan tidak hanya unsur hara makro dan mikro, tetapi sumber karbohidrat yang pada umumnya berupa gula menggantikan karbon yang biasanya dihasilkan dari atmosfer melalui melalui proses fotosintesis. Formulasi media kultur jaringan pertama kali dibuat berdasarkan komposisi larutan yang digunakan untuk hidroponik, khususnya komposisi unsur-unsur makronya. Unsur-unsur hara diberikan dalam bentuk garam-garam anorganik. Komposisi media dan perkembangan formulasinya didasarkan pada jenis jaringan, organ dan tanaman yang digunakan serta pendekatan dari masing-masing peneliti. Beberapa jenis sensitif terhadap konsentrasi senyawa makro tinggi atau membutuhkan zat pengatur tertentu untuk pertumbuhannya Beberapa media dasar yang banyak digunakan antara lain: 1. Media dasar Murhasige dan skoog (1962) yang dapat digunakan untuk hampir semua jenis kultur, terutama pada tanaman herbaceous. 2. Media dasar B5 untuk kultur sel kedelai, alfafa, dan legume lain. 3. Media dasar White (1934) yang sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat. 4. Media dasar Vacin dan Went yang biasa digunakan untuk kultur jaringan anggrek. 5. Media dasar Nitsch dan Nitsch yang biasa digunakan dalam kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel. 6. Media dasar Schenk dan Hildebrandt (1972) atau media SH yang cocok untuk kultur jaringan tanaman-tanaman monokotil. 7. Medium khusus tanaman berkayu atau Woody Plant Medium (WPM) 8. Media N6 untuk serealia terutama padi. Dari sekian banyak media dasar yang paling sering dan banyak digunakan adalah komposisi media dari Murashige dan Skoog. Kadang-kadang untuk kultur tertentu, kombinasi zat kimia dari murashige dan Skoog masih tetap digunakan tetapi konsentrasinya yang diubah. Sebelum membuat media tumbuh untuk kultur jaringan tanaman, perlu dilakukan upaya pembuatan stok-stok nutrisi pembentuk media. Contoh seperti: stok makro MS, mikro MS, vitamin MS dan zat pengatur tumbuh. Manfaat pembuatan stok adalah mempermudah persiapan media. Nutrisi makro MS terdiri dari: N, P, K, Ca, Mg dan S, kemudian mikro MS terdiri dari: B, Mo, Co, Fe, Cu, Zn, Mn, I. Sedangkan penyusun vitamin MS terdiri dari: myo-inositol, vitamin B-1 (Thiamine HCl), B-3 (Nicotinamide), B-6 (Pyridoxine HCl) dan Asam Amono Glysin.

2 Setiap larutan stok dapat dipergunakan sampai liter media, bahkan larutan stok mikro dapat dipergunakan sampai liter media. Larutan stok dapat disimpan ditempat yang bertemperatur rendah dan gelap. Pembuatan larutan stok berdasarkan pengelompokan dalam : Stok makro, stok mikro, stok Fe, stok vitamin dan stok hormone terutama bila larutan stok tidak disimpan terlalu lama (segera digunakan habis). Stok hormone dapat disimpan antara 2-4 minggu, sedangkan stok hara dapat disimpan 4-8 minggu. Dengan adanya larutan stok, pembuatan media selanjutnya hanya dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja. Hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan larutan stok adalah penyimpanan (daya simpan) larutan. Larutan yang sudah mengalami pengendapan, tidak dapat digunakan lagi. Pengendapan larutan stok umumnya terjadi bila kepekatan dapat dihindari dengan membuat larutan yang tidak terlalu pekat atau tidak menggunakan larutan campuran, yaitu dengan membuat satu larutan stok hanya untuk satu jenis bahan (terutama untuk unsur hara makro). Kondisi simpan juga diperhatikan, karena ada beberapa bahan yang tidak tahan dalam suhu tinggi atau cahaya. Larutan stok kadang-kadang ditumbuhi mikroorganisme. Larutan stok yang terkontaminasi mikroorganisme ini, juga tidak dapat digunakan lagi. Oleh karena itu kondisi simpan harus dijaga kebersihan dan tempat (wadah) larutan harus diusahakan cara-cara pembuatan larutan stok untuk media Murashige dan Skoog (1962). Stok Hara Makro. Senyawa-senyawa sumber unsur hara makro diperlukan dalam jumlah yang cukup besar. Oleh karena itu sebaiknya dibuat dalam larutan stok tunggal. Selain itu jenis anion senyawa sumber unsur hara makro tidak sama, kemungkinan hal tersebut akan mempercepat pengendapan larutan bila dibuat larutan stok campuran. Persiapan Membuat Larutan Dalam Satuan (Unit) Konsentrasi dari satu substrat tertentu dalam media dapat digambarkan dalam variasi satuan (unit) adalah sebagai berikut ini: Satuan Berat digambarkan sebagai milligram per liter (mg/l atau dapat ditulis sebagai mgl = 1,0 mg/l atau 1 part per million (ppm) atau seper juta bagian = 0,1 mg/l 10-9 = 0,001 mg/l atau µg/l Satuan Konsentrasi. Satu molar larutan (M) suatu senyawa sama dengan massa molekul dalam gram per liter. 1 molar (M) = massa molekul dalam g/l. 1 mm = massa molekul dalam mg/l atau 10-3 M. 1 µm = massa molekul dalam µg/l atau 10-6 M atau 10-3 mm.

3 Konversi dari mili molar (mm) ke mg/l. Sebagai contoh, massa molekul auxin : 2,4 D = 221,0. 1 M larutan 2,4 D berisi 221,0 g/l. 1 mm larutan 2,4 D berisi 0,221 g/l = 221,0 mg/l 1 µm larutan 2,4 D berisi 0, g/l = 0,221 mg/l Konversi dari mg/l ke mili molar (mm) Massa molekul CaCl 2. 2H 2 O = x x x 16 = Massa atom: Ca = ; Cl = ; H = 1.008; O = 16 Jika 440 mg/l CaCl 2. 2H 2 O akan di konversikan ke nm, maka: Jumlah mm CaCl 2. 2H 2 O Jadi 440 mg/l CaCl 2. 2H 2 O = 2.99 mm. = Jumlah mg dari CaCl 2. 2H 2 O Massa molekul dari CaCl 2. 2H 2 O = ,018 = 2.99 mm II. TUJUAN Memahami dan mempraktekkan langkah-langkah pembuatan stok-stok nutrisi. III. BAHAN DAN ALAT A. Bahan (1) Penyusun makro MS terdiri dari: KNO 3, NH 4 NO 3, KH 2 PO 4, CaCl 2.2H 2 O, MgSO 4.7H 2 O (2) Penyusun mikro MS terdiri dari: H 2 BO 4, FeSO 4.7H 2 O, NaEDTA, Na 2 MoO 4.7H 2 O, CoCl 2.6H 2 O, CuSO 4.5H 2 O, ZnSO 4.7H 2 O, MnSO 4.H 2 O, KI. (3) Penyusun vitamin MS ter diri dari: myo-inositol, vitamin B-1 (Thiamine HCl), B-3 (Nicotinamide), B-6 (Pyridoxine HCl) dan Asam Amono Glysin. (4) Zat pengatur tumbuh: (a) Sitokinin: BA/BAP (6-Benzyl Amino Purine) (b) Auksin: NAA (Naphtalene Acetic Acid), IBA (Indole Butyric Acid) (5) NaOH/KOH 1 N dan HCl 1 N untuk melarutkan zat pengatur tumbuh (6) Air destilasi B. Alat (1) Erlenmeyer 500 ml untuk stok makro, 250 ml untuk stok mikro dan vitamin, ml untuk stok zat pengatur tumbuh. (2) Botol semprot (3) Aluminium foil (4) Hot Plate + Magnetic Strrer + Spin Bar

4 IV. CARA KERJA A. Hitungan Bahan yang Akan Ditimbang Pembuatan stok nutrisi penyusun media tumbuh kultur jaringan tanaman tidak terlepas dari ketersediaan peralatan laboratorium yang ada. Seperti peralatan: volume botol stok, volume pipet dan jenis timbangan. Hitungan stok nutrisi dan zat pengatur tumbuh adalah sebagai berikut: (1) Stok Makro MS (Murashige Skoog) - Kebutuhan NH 4 NO 3 = 1650 mg/l media - Volume pipet yang tersedia = 25 ml - Volume botol stok yang tersedia = 500 ml - Berapa banyak kebutuhan bahan tersebut ditimbang? - Hitungan: 1650 mg / 25 ml = 66 mg/ml Maka kebutuhan bahan yang harus ditimbang untuk volume stok 500 ml: 66 mg/ml x 500 ml = mg = 33 gram (2) Stok Mikro MS - Kebutuhan H 3 BO 3 = 0,83 mg/l media - Volume pipet yang tersedia = 10 ml - Volume botol stok yang tersedia = 250 ml - Berapa banyak kebutuhan bahan tersebut ditimbang? - Hitungan: 0,83 mg / 10 ml = 0,083 mg/ml Maka kebutuhan bahan yang harus ditimbang untuk volume stok 250 ml: 0,083 mg/ml x 250 ml = 20,75 mg = 0,021 gram (3) Stok Vitamin MS - Kebutuhan BA = 1 mg/l media - Volume pipet yang tersedia = 1 ml - Volume botol stok yang tersedia = ml - Berapa banyak kebutuhan bahan tersebut ditimbang? - Hitungan: 1 mg / 1 ml = 1 mg/ml Maka kebutuhan bahan yang harus ditimbang untuk volume stok ml: 1 mg/ml x ml = mg = 0,1 gram B. Hal-hal yang Perlu Diperhatikan (1) Pelarutan awal NH 4 NO 3 dan CaCl 2.2H 2 O tidak boleh disatukan, karena NH 4 NO 3 larut sambil menarik energi dan diwujudkan dalam bentuk dingin.sedangkan CaCl 2.2H 2 O larut sambil melepaskan energi dan diwujudkan dalam bentuk panas.

5 (2) Bila suhu kedua Bila suhu kedua senyawa makro tersebut sudah mendekati suhu kamar, maka kedua senyawa tersebut dapat disatukan. (3) Pembuatan FeNaEDTA, NaEDTA dipanaskan sampai bersuhu C kemudian baru dicampurkan dengan FeSO 4.7H 2 O yang sudah larut. Larutan FeNaEDTA ditempatkan di dalam botol yang gelap/coklat untuk menghindari perusakan oleh cahaya. (4) Bahan pelarut zat pengatur tumbuh (zpt) tidak sama, misalnya antara jenis sitokinin dan auksin (auksin bersifat asam, pelarutnya bersifat basa (NaOH/KOH) dan sitokinin bersifat basa, pelarutnya bersifat asam (HCl). C. Sistematika Pembuatan Media (1) Menimbang bahan-bahan penyusun stok nutrisi dengan menggunakan timbangan analitis digital sesuai dengan hitungan. (2) Selanjutnya dengan memperhatikan rambu-rambu pembuatan stok nutrisi dan zpt, bahan-bahan tersebut dicampur dengan melarutkannya dengan menggunakan air destilasi/naoh/koh. (3) Selain itu jangan lupa menuliskan nama stok nutrisi/zpt + tanggal pembuatannya. (4) Stok nutrisi/zpt kemudian disimpan di dalam kulkas bila tidak langsung dipergunakan. V. TUGAS (Perorangan) 1. Jelaskan mengapa ada pemisahan pembuatan stok nutrisi dengan bahan NH 4 NO 3 dan CaCl 2.2H 2 O? 2. Bagaimana cara membuat stok zat pengatur tumbuh dari jenis Auksin dan Sitokinin? 3. Bobot molekul benziladenin (BA) adalah 225. Berapa BA yang harus Anda timbang untuk membuat 200 ml larutan stok BA dengan konsentrasi 1 mm? Jika Anda akan membuat2 L media MS dengan konsentrasi BA 5µM, berapa ml larutan stok BA yang harus ditambahkan ke dalam media? 4. Hitung: a. Kebutuhan bahan dalam gram, bila konsentrasi CaCl 2. 2H 2 O = 500 mg/l 1. Volume pipet = 5 ml 2. Volume stok = 250 ml b. Volume pipet, bila konsentrasi MgSO 4.7H 2 O = 150 mg/l 1. Volume stok = 500 ml 2. Kebutuhan bahan = 5 gram

6 Tabel 1. Nama Stok Formulasi Media MS (Murashige dan Skoog, 1962) dan Alternatif Lain Pengelompokan Senyawa Kimia dalam Pembuatan Larutan Stok Senyawa dalam Larutan Stok Konsentrasi dalam Media MS (mg/l) Konsentrasi dalam Larutan Stok (mg/l) Volume Larutan Stok yang Dibutuhkan per Liter Media (ml) A (10x) NH 4 NO B (10x) KNO C (x) CaCl 2.2H 2 O D (10x) KH 2 PO E (1.000x) F (200x) G (x) Vitamin (1.000x) Myo-inositol (50x) Nama ZPT H 3 BO 3 Na 2 MoO 4.7H 2 O CoCl 2.6H 2 O KI MnSO 4.H 2 O ZnSO 4.7H 2 O MgSO 4.7H 2 O CuSO 4.5H 2 O FeSo 4.7H 2 O Na 2 EDTA Tiamin-HCl Piridoksin Asam nikotinat Glisin 6,2 0,25 0,025 0,83 16,9 8, ,025 27,8 37,3 0,1 0,5 0,5 2, Myo-inositol Sukrosa BA NAA IAA Agar-agar Sesuai kebutuhan Tidak larutan stok dibuat Tidak dibuat larutan stok Sesuai kebutuhan