Supaporn Kownarumit 1 James N. Miller 2 1 Department of Science Service, Thailand, 2 Department of Chemistry, Loughborough University, UK

Transcription

1 Supaporn Kownarumit 1 James N. Miller 2 1 Department of Science Service, Thailand, 2 Department of Chemistry, Loughborough University, UK Abstract This project has investigated simultaneous screening enzyme inhibitors using flow injection fluorescence spectroscopy and chemometric method to resolve fluorescence strongly overlapping spectra. The dual screening assay has been based on flow injection analysis methodology, with immobilized enzyme on solid phase reactors, i.e. alkaline protease and alkaline phosphatase respectively, to investigate enzyme inhibitors, namely 3-nitrophenylboronic acid and sodium orthovanadate. The excitation-emission fluorescence spectra are strongly overlapped, which do not permit their direct determination without previous separation by conventional methodologies. Here, a method is proposed for the determination of these chemicals by the use of a chemometric technique: a full-spectrum multivariate calibration method, partial least-squares (PLS-1). The experimental calibration set was designed with 13 samples. The concentrations were varied between 1-5 microgram per milliliter (µg/ml) for 3-nitrophenylboronic acid and µg/ml for sodium orthovanadate. The emission fluorescence spectra were recorded between nanometers, and analyzed with Unscrambler software, using PLS-1 and full cross validation. The correlation coefficients were for 3-nitrophenylboronic acid and for sodium orthovanadate. For external validation, another set of 10 samples was used. The satisfactory results were obtained. The actual and predicted were consistent for most of the mixtures tested. All the predicted concentrations were % and % for their actual concentrations for 3-nitrophenylboronic acid and sodium orthovanadate respectively. Keywords : Chemometrics; enzyme inhibitors; flow injection analysis; fluorescence spectroscopy; PLS-1 25 * To whom correspondence should be addressed. supaporn_kow@hotmail.com, Tel. & Fax

2 ÿ æ â«πƒ µ 1 James N. Miller 2 1 µ å 2 Department of Chemistry, Loughborough University, UK 26 àõ ß π«π È â æ π µ «Õ ÈÕßµâπ Õß Èß Õπ å 2 π â à 3- π µ øππ π Õ ÕÕ «π µõ à ßµàÕ π ËÕß â π ø Õ π Á πø ŸÕÕ µ å æ ËÕ âªí À À ËÕ âõπ πõ à ß Õßø ŸÕÕ π å ª µ Õ â π ø Õ π Á πæ âõ â«õ µõ å Ëß Õß Áß ËÕ å â«õπ å 2 π Õ Õ πå ª µ Õ Õ πåøõ ø ËßµàÕ π Õπÿ ª µ Ë â À ËÕ âõπ πõ à ß Ëß à Õ â µ ß â««ª µ ª» àõπ µà π Ëπ È âªí À â â π ß µ å π Àπ Ëß Ëß ªì𫪠µ πà µ «ª Ë â Èß ª µ π «Àå Õ â à æ å «å (PLS-1) ÿ µ π Ë âª Õ â«13 µ «Õ à ß Ëß «â âπ Õß 3- π µ øππ π Õ π à«ß 1-5 µàõ µ ÕÕ «π µ π à«ß µàõ µ π «â ø ŸÕÕ π å Õß ª µ º π à«ß ««Ëπ À«à ß π π µ «Àå â«õ π Õ å Õ åø «å â PLS-1 π øÿ Õ «π (FCV) â à ª Ï À æ π å (r) = À 3- π µ øππ π Õ ÕÕ «π µ µ À µ «Õ â â Õß«â Õߺ Õ ÿ Àπ Ëß π«π 10 µ «Õ à ß Ëß À⺠Õß ªìπ Ëπà æõ à Ë â π à â ß à ß «â âπ Õß à Ë π âõ Ÿà π à«ß % % Õß «â âπ ß Õß3- π µ øππ π Õ ÕÕ «π µ µ : µ å µ «Èß Õπ å «Àå â«π ø Õ π Á π ø ŸÕÕ π å ª ªï Õ æ «å π π ø Õ π Á πø ŸÕÕ ªìπ«Õ Ëπ πõ à ß æ àà πà À «àπ Ëß «âõ «ªìπµâπ π ËÕß ªìπ π Ë æ «Ÿß ª Õ ßà µàõ â à â à à Ÿß π ßµàÕæà«ß â Õ À π Õ à ß Áµ Ë Ÿ «Àå â«π π È ª µ Ë àõπ â ß «â ß ß π«πâ Ë âõπ À ËÕ π (overlapped) ËÕ«ÀåÀ Õß åª Õ æ âõ Ê π ÀâµâÕß â«π µà ßÊ àõπ À Õ Õ µâõß â«ë æ ß Ÿß Èπ Àâ «à â à æ Ë Èπ Õ Ë«ª ªìπ Õ æ ß 1 Õß åª Õ µàõ 1 Õ µà πà Ê àπ µ «Õ ÈÕßµâπ Õß (drug screening) ªìπµâπ Õ 2 µ «À Õ «à Õ à ßµàÕ π ËÕßπ «à âõ Èߪ À «à â à «Àπ Ëß Ë â π â ªí À Õ ª µ Ë âõπ À ËÕ Õ À Õß åª Õ Õ à ßµàÕ π ËÕß Õ â π Àπ Ëß Õß µ å (Chemometrics) â à π µ πà µ «ª (Multivariate calibration) Ëß ªìπ π Ë «π π «â âπ Õß âπà ËÕ Õ Ÿ µâõß ª» â Èß «Ÿß Õßæ

3 æ Èπ Ë Õßæ 1 ªí ÿ π«µ πà µ «ª ªìπ π Ë Ë ÿ «Àπ Ëß π À «â âπ Õß Õߺ Ë âõπ Ëß ª µ Õß Õ π à«ß ««Ëπ â ß π Ëß âõ À Õß π π È Õ Àâ Õ Á«Èπ π ËÕß àµâõß ÈπµÕπ Õߺ àõπ «Àå2 µ πà µ «ª À π 3 PCR (Principal component regression) PLS (Partial least-squares regression) ªìπ π Ë â πõ à ß «â ß «ß Èß π ß µ Ëß «âõ ªìπµâπ π PLS â Ÿ æ π Èπ Wold 4 µàõ π ª âª πåõ à ß PLS π Èπ µà ß PCR µ ß Ë ªìπ π Ë â Èß âõ Ÿ Õß ª µ âõ Ÿ «â âπ π «Àå PLS 2 Ÿª Õ PLS-1 PLS-2 PLS-1 π Èπ â PCR Õ π«π«π Õߪí À (Number of principal components or factors, PCs) Ë À æ ßÕß å ª Õ «π µà Èß Õß π«µà PLS-2 â ÿ Õß åª Õ Õ à ßµàÕ π ËÕß PLS-1 PCR ªìπ π Ë Àâº Õ â ß π ªìπ à«π À à5,6 µà Õß Õß De Jong 7 Ragno 8 æ «à PLS-1 À⺠π Ë «à PCR æ π Ë âõπ À ËÕ Õß ª µ ªìπÕ à ß ßπ Èπ π ß π«π È â æ π PLS-1 à π Èπ «µ πà µ «ª ÈπÕ Ÿà ÿ æ Õßµ «Õ à ß µ «ª µà ßÊ Ë â µ «Õ à ß ßπ Èπ µâõß ª º Õß ø µ π àõπ Ë â π π «â âπ Õß Õ Õ â â Õß«(Method validation) Ÿ â æ ËÕµ «Õ «â â Õß Ÿª µ π (Calibration model) â Ÿª Õß â â µ µà ß πõ à ß π µàõ æ µ π ß«à π Ë ÈπÕ àπà ËÕ Õ æ ËÕ Àâ æ µ π À µàõ π àõπ Ë â ø µ π µâõß Õ π«π Õß PCs Ë À µ «ª (variables) Ë â µ «Õ à ß Ë àõ Ÿà π ±å (outliers) ÕÕ àõπ «µ ÿª ß å Õßß π«π È æ ËÕª π à «ªìπ ª â Õß â π µ πà µ «ª â à PLS-1 À µ «Õ ÈÕßµâπ Õßµ «Èß Õπ å Õ à ßµàÕ π ËÕß π ø Õ π Á πø ŸÕÕ âõ å Õπ å Õ µõ å «ÿ Õÿª å «1. µ Õ µõ å Õ å- Õπ å â à Õ πå ª µ Õ (Alkaline protease, AlkP) Õ πåøõ ø (Alkaline phosphatase, AP) π æ ÿß «æ æ Õ µ â ß å (Pierce UltraLink Biosupport medium) µ Ÿà Õ Õß ß 9 ÿ ß π Õ πå â«π 3.0 x 2.5 πµ µ 2. µ µ Èßµâπ (substrates) â à Õ ªï Õø Õ -Õ ø π Õπ Ÿ µ (Bodipy FLα -casein conjugates) ø ŸÕÕ π øõ øµ (Fluorescein di-phosphate, FDP) µ Ÿà Õ Õß ß 10,11 µ Èßµâπ Èß Ÿàπ È Àâø ŸÕÕ π åµë µà â Õπ å Ë À â à Õ πå ª µ Õ Õ πåøõ ø ªØ π «Ë À 12 Àâ â Õ ªï Õø Õ ø ŸÕÕ π µ Ëß ªìπ Ë Àâø ŸÕÕ π å Ÿß Ÿµ ß â ß Õß ø ŸÕÕ π Õ ªï Õø Õ ß π æ Ë 1 (a) (b) µ 27 (a) (b) λ ex = 494 nm, λ em = 520 nm, MW = λ ex = 504 nm, λ em = 513 nm, MW = æ Ë 1 ß â ß ÿ µ Õß ø ŸÕÕ π (a) Õ ªï Õø Õ (b) 10

4 3. «ø ŸÕÕ π å âø ŸÕÕ π å ª µõ å ËÀâÕ Hitachi ÿàπ F-4500 ««â ß Õß excitation emission = 10 π π µ â time scan mode â«««ëπ Õß excitation emission = 480 π π µ 514 π π µ µ π ø å À µ «Õ Èß Õπ åõ à ßßà Ë â πß π«π È ß π æ Ë 2 å Õ πµ ø øõ å Ë «â âπ 0.02 å Ë «ªìπ 8.5 Ÿ ªíö Õ à ß â Ê â«õ µ Á«1.2 µ µàõπ ºà π Õ µõ å 2 µ «Õ Õ µõ å Ë ËÕ å â«alkp Õ µõ å Ë ËÕ å â«ap µ µàõ Õπÿ ( æ Ë 3) Ëß àõ Ÿà πõà ß Õß ËÕßÕ ß ÕπÈ ËÕÿ À Ÿ 37 Õß» 28 æ Ë 2 ºπ æ ß π ø å À µ «Õ Èß Õπ å â«ø Õ π Á π A = ø øõ å, B = ªíö, C = Õ π Á π«å«, D = Õπ å Õ µõ å, E = ËÕßÕ ßπÈ «ÿ Õÿ À Ÿ, F = ø ŸÕÕ π å ª µõ å G = ˵âÕß Èß æ Ë 3 Õ µõ å ËÕ å â«alkp AP µ ËßµàÕ Õπÿ π Èπ Ë â π Õߪ Õ â«µ Èßµâπ 2 µ «Õ Õ ªï Õø Õ -Õ ø π Õπ Ÿ µ Ë «â âπ 4 µàõ µ, ø ŸÕÕ π øõ øµ Ë «â âπ 0.5 µàõ µ Èß Õπ å 2 µ «Õ 3- π µ øππ π Õ (3-Nitrophenylboronic acid, 3-NPBA) Ë «â âπ À«à ß 1-5 µàõ µ ÕÕ «π µ (Sodium orthovanadate, VI) Ë «â âπ À«à ß µàõ µ Èß 4 π È Ÿ â Ÿà ºà πõ π Á π«å«æ âõ sample loop π 50 µ µ «Õ à ß À à π È À ºà π Õ µõ å Èß Õß ª ßø ŸÕÕ π å µõ å À ß ªìπ «22 «π À ÿ ªíö â«õ (manual) π ø ŸÕÕ π å ª µ Èß ª µ ( π π µ ) âõ Ÿ Õß ª µ Ÿ π π æ Õß ASCII format â«ß ª ß ªìπ ÕÁ ø å àõπ Ë «Àå ⫪ Õ π Õ å (Unscrambler) ø ÈßÀ Ë â Õ π Õ å Õ åø «å ß ø µ π ªìπ øñ Õ «â â Õß ø ªìπ æÿ à«ß «â âπ Ë Õ π ÈÕ Ÿà π à«ß ø µ π Ë ªìπ âπµ ß (Linear calibration range) Õß º Ë â πß π«π È À «À Õß æ µ π â π PLS-1 FCV (Full cross validation) æ ËÕ«Àå ª µ Õß µ «Õ à ß π««â âπ Õß 3- π µ øππ π Õ ÕÕ «π µ π Õߺ

5 º Õß «å 1. âõ Ÿ ª µ â«pls-1 Õß åª Õ Õß º πµ «Õ à ß Õß ÿ µ π (calibration set) 13 µ «Õ à ß ß πµ ß Ë 1 Õ Õß º ß π æ Ë 4 PLS-1 ªìπ π Ë«Àå æ ß 1 Õß åª Õ π µà Èß «Õ π«πõß åª Õ À Õªí À (PCs) Ë À ªìπ Ëß ªìπ æ ËÕ Àâ PLS-1 π âõ à ß Ÿ µâõß Õ âà «13 µà π Ëπ È â æ ß à «ª ª «π Õß â â Õß Y Ë ß À Õ (Residual Y validation variance, RYVV) π æ π«π Ë À Õß PCs FCV ªìπ π Ë Õ µ «ß µÿõõ µ «â à«π Ë À Õ ø µ π Õ à ßπ È ª π ÿ µ «ß µ π Ëπ È â 13 ª µ ªìπ ÿ µ π ßπ Èπ 12 ª µ Ÿ â æ ËÕ ø µ πà Õ â π π «â âπ Ë «â âπ Õßµ «Õ πµ «Õ à ß Ÿ Õ ÕÕ 1 Èß ËÕ ø à π «â âπ Õß «À µà Õß åª Õ â Õ å ø (Score plot) Ÿ π «å (Root mean square, RMSE) RYVV ª Ï À æ π å (correlation coefficient, r) æ ËÕ ß ß à «ËÕπ Ë π «Àå ÿ æ Õß «À Õß âõ Ÿ µàõ âπµ ß Ë Ÿ π«õ π Õ å Õ åø «å14 ß ß π æ Ë 5 6 µ ß Ë 1 Õß åª Õ Õß Õߺ πµ «Õ à ß Õß ÿ µ π µ «Õ à ß «â âπ Õß 3- π µ øππ π Õ, «â âπ Õß ÕÕ «π µ, µg/ml,µg/ml æ Ë 4 Õ Õß º π ÿ µ π Õß åª Õ πµ ß Ë 1 [3-NPBA] µg/ml

6 æ Ë 5 ø Õß ÿ µ π Õß ÕÕ «π µ «Àå â«õ π Õ å â PLS-1 FCV æ Ë 6 ø Õß ÿ µ π Õß 3- π µ øππ π Õ «Àå â«õ π Õ å â PLS-1 FCV 30 æ Ë 5 Õ å ø À ÿ µ π Õß ÕÕ «π µ âpls-1 FCV ß Àâ ÀÁπ«à âõ Ÿ ÈßÀ Õßµ «Õ à ßÕ Ÿà π à«ß æ Ë Õß âõ Ÿ X à RYVV ß PCs ªìπ 3 ßπ Èπ â à π È π π µàõ ª à RMSE Ë 3PCs π Èπ àõπ â ßµË (0.006 À RMSE Õß µ π, RMSEC 0.02 À RMSE Õß µ «Õ «â â, RMSEP) à«π à r = ßπ Èπ º Õß Ë âπ È ß Àâ ÀÁπ«à ÿ µ ππ È Àâ æ PLS-1 Ë π ª â π ÈπµÕπ π â Õ à ß Áµ π æ Ë 6 â à r æ ß à RMSE Á àõπ â ß Ÿß (0.29 À RMSEC 0.44 À RMSEP) à RYVV Õß µ «Õ à ß Ë 13 µ µà ß µ «Õ à ßÕ ËπÊ Õ à ß ÀÁπ â π ( æ Ë 7) ßπ Èπµ «Õ à ßπ È ß ªìπµ «Õ à ß Ë à â ±å (outlier) ßµâÕß ÕÕ ÿ µ ππ È â«ß π«õ ÈßÀπ Ëß Ëß π«æ «à âº Õ Ë Èπ ß ß π æ Ë 8 à RYVV ß à PCs Ë À = 2 RMSE Ë PCs = 2 Èπ Õ Èß à r Ÿß Èπ â«( ) ß â ÿ µ π ˪ â«π È π π µàõ ª 2. π à Ë ß π (Prediction and deviations) æ ËÕ Õ «À â â Õß «ß µ Õߺ π«π 10 µ «Õ à ß Àâ «â âπ Õß Èß 2 Õß åª Õ (3- π µ øππ π Õ ÕÕ «π µ) Ë «â âπ µàõ µ π «â âπµà ßÊ ( ß π µ ß Ë 2) æ Ë 7 ø Õß «ª ª «π Õßµ «Õ à ß Ë ß À Õ À µ «Õ µ «Õ à ß Ë à â ±å Õß 3- π µ øππ π Õ

7 æ Ë 8 ø Õß ÿ µ π Ë à outlier Õß 3- π µ øππ π Õ «Àå â«õ π Õ å µ ß Ë 2 «â âπ Õß º (3- π µ øππ π Õ, 3-NPBA ÕÕ «π µ, VI) Ë â π ÿ âõ Ÿ À π µ «Õ à ß «â âπ Õß 3-NPBA, µg/ml «â âπ Õß VI, µg/ml º Õß πµ ß Ë 3 æ Ë 10 ÀÁπ â«à à Ë â π à â ß π ªìπ Õ à ß à ß «â âπ Õß à Ë π â Õ Ÿà π à«ß % % Õß «â âπ ß Õß 3- π µ øππ π Õ ÕÕ «π µ µ à Ë ß πõ Ÿà π à«ß 10% À Èß 3- π µ øππ π Õ ÕÕ «π µ «âπ µ «Õ à ß Ë 5 (23%) À 3- π µ øππ π Õ µ «Õ à ß Ë 7 (34%) À ÕÕ «π µ º Õß Ë âπ ªìπ Ë πà æõ π ËÕß ª µ Õß Õ ªï ø ŸÕÕ π À ËÕ âõπ π ( ß π æ Ë 9) «µ ÿª ß å Õßß π«π È Á æ ß æ ËÕ µ «Õ ÈÕßµâπ (Screening) à π Èπ 31

8 µ ß Ë 3 º «Àå â«õ π Õ å À 3- π µ øππ π Õ (3-NPBA) ÕÕ «π µ (VI) â«pls-1 FCV 32 µ «Õ à ß [ à ß], [ à π ], % Ë ß π % Recovery µg/ml µg/ml 3-NPBA VI 3-NPBA VI 3-NPBA VI 3-NPBA VI æ Ë 9 ª µ Ë âõπ À ËÕ π Õß Õ ªï Õø Õ ø ŸÕÕ π

9 [3-NPBA], ug/ml (a) µ «Õ à ß ÿª [3-NPBA], ug/ml à π à ß æ Ë 10 ª º π à ß (a) 3- π µ øππ π Õ (b) ÕÕ «π µ ªí ÿ π µ å â Ÿ æ π Èß ß ƒ Æ π âõ à ß «â ß «ß πà æ «Àå15-17 àõ Èß Ëø ŸÕÕ π å ª µ âõπ À ËÕ π ªìπÕ à ß ÀâµâÕß «à â à π àõπ Õ µà π µ πà µ «ª àπ PLS-1 Ëß ªìπ π Ë â Èß ª µ π «Àå ªìπ π Àπ Ëß Ë Õ Õߺ À Õß åª Õ Õ à ßµàÕ π ËÕß à ªìπµâÕß ÕÕ π àõπ Ëæ π Èπ πß π«π È ªìπ Ÿª Ëßà Ëß æ π âõ â ËÕß Õ Ë À àπ ø Õ π Á πõ â Õ µ π µ π â Õ Ëß (b) µ «Õ à ß à««ëõπ Õß Õ â π ËÕß â À ÿ ªíö Õ µ π µ à«àâ (capture) ª µ Õß º â Ÿ µâõß àπ Ëß Èπ Õ à ß Áµ Õ ÈÕßµâπ Õß Èß Õπ åõ à ßµàÕ π ËÕß â ø Õ π Á πø ŸÕÕ PLS-1 Ë â πß π«π È À⺠ªìπ Ëπà æõ π À⺠Õß Ë À æ π ª ª ÿßµàõ ª ªìπª πå Õ à ß µàõ Õ Õߺ À Õß åª Õ Ë âõπ À ËÕ Õß ª µ Ÿß π ª æ π π µ «Õ ÈÕßµâπ À drug candidates À Õ «π µ «Õ ÈÕßµâπ πõÿµ À µà ßÊ 33

10 Õ Õâ ß Õ ß 34 (1) Brereton, R. G Introduction to multivariate calibration in analytical chemistry. Analyst 125: (2) Bautista, R. D., et al Simultaneous spectrophotometric determination of drugs in pharmaceutical preparations using multiple linear regression and partial least-squares regression, calibration and prediction methods. Talanta 43: (3) Miller, J. N. a. M., J. C Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry; fourth ed.; Pearson Education Limited: Essex. (4) Wold, H Partial Least Squares. Encyclopedia of statistical Sciences, Vol. 6; Wiley: New York p (5) Thomas, E. V., and Haaland, D. M Comparison of multivariate calibration methods for quantitative spectral analysis. Analytical Chemistry 62: (6) El-Gindy, A., Emara, S., and Mostafa, A Application and validation of chemometrics-assisted spectrophotometry and liquid chromatography for the simultaneous determination of six-component pharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41: (7) De Jong, S Short communication: PLS fits closer than PCR. Journal of Chemometrics 7: (8) Ragno, G., Loele, G., and Risoli, A Multivariate calibration techniques applied to the spectrophotometric analysis of one-to-four component systems. Analytica Chimica Acta, 512: (9) PIECE Chemical Company PIERCE Instructions: UltraLink TM Biosupport Medium. (10) Molecular Probes Inc. Amines-reactive probes.[online] [cited date : 30 September 2002] Available from internet : www. probes.com. (11) Molecular Probes Inc Product information: alkaline and acid phosphatase substrates: FDP, MUP, DiFMUP and DDAO phosphate. (12) Kownarumit, S Multiplex screening using enzyme inhibition, fluorescence detection and chemometrics. In Chemistry; Loughborough University: Loughborough. (13) Martens, H., and Naes, T Multivariate Calibration; John Wiley & Sons Ltd.: Chichester. (14) CAMO ASA User manual: The Unscrambler; CAMO ASA: Norway. (15) Lavine, B. K., and Workman, J. Jr Chemometrics. Analytical Chemistry. 74: (16) Mammarella, E. J.; Rubiolo, A. C Predicting the packed-bed reactor performance with immobilized microbial lactase. Process Biochemistry 41: (17) Wang, Z. P., Shi, L. L., Chen, G. S., and Cheng, K. L Multivariate spectrofluorimetry of ultra trace zirconium(iv) and hafnium(iv) assisted by several chemometrics methods. Talanta 51: